【摘要】 目的 探讨大鼠滑膜间充质干细胞（synovium-derivedmesenchymal stem cells，SMSCs）生物学特性及诱导成骨的可行性，评估SMSCs复合羟基磷灰石/壳聚糖/ 聚乳酸（hydroxylapatite/chitosan/polyL-latic acid，HA/CS/PLLA）支架材料在体内异位成骨能力。方法 采用酶消化法和贴壁法分离培养SMSCs，并利用流式细胞仪检测细胞表型，SMSCs成脂及成骨诱导后分别行油红O染色、ALP 染色和茜素红染色鉴定。取第3 代SMSCs，成骨

诱导1、7、14、21、28 d 后，采用实时荧光定量PCR 检测骨钙素（osteocalcin，OCN）、Ⅰ型胶原、ALP 以及Runx- 2mRNA 表达情况；成骨诱导后1、3、5、7、9、11 d，采用ELISA 法检测ALP 活性；成骨诱导后7、14、21、28 d，采用茜素红S 法检测钙盐沉积；以正常培养SMSCs 作为对照组。体内实验：取SD 大鼠24 只，随机分为实验组和对照组（n=12）；取第3 代SMSCs 接种于HA/CS/PLLA 支架材料，体外复合培养72 h 后植入实验组大鼠右下肢肌袋，对

照组大鼠植入单纯HA/CS/PLLA支架材料；术后4、8 周通过X 线片及组织学观察分析SMSCs 体内成骨情况。 结果 提纯后SMSCs CD147、CD90、CD105、CD44 表达超过95%，而CD117、CD34、CD14、CD45 表达低于10%；油红O 染色可见红色脂滴形成，茜素红染色可见红色钙化灶，ALP染色可见细胞质呈咖啡样深染。实时荧光定量PCR检测示，SMSCs 成骨诱导7 d，Ⅰ型胶原、ALP、Runx-2 mRNA 表达显著增加，诱导14 d OCN mRNA 表达显著增加。成骨诱导后5、7、9、11 d ALP 活性明显高于对照组，7 d 时达峰值（P<0.05）。成骨诱导14 d，钙含量显著增加，且随诱导时间延长钙含量逐渐增加（P<0.05），且均高于对照组（P<0.05）。体内实验术后4、8 周影像学和组织学观测结果显示，两组均可见新生骨形成，但实验组成骨量明显多于对照组（P<0.05）。结论 SMSCs 在体内、体外均可诱导成骨，可成为骨组织工程的种子细胞。

【关键词】 滑膜间充质干细胞；成骨诱导；茜素红；ALP；新骨形成；大鼠

骨质破坏和骨缺损是临床常见疾病，组织工程技术的发展为骨缺损修复提供了新方法。滑膜间充质干细胞（synovium-derivedmesenchymal stem cells，SMSCs）是目前组织工程研究热点。SMSCs 易于获

取，体外增殖和分化能力强，较其他来源MSCs有明显优势。然而，SMSCs在体外诱导成骨以及在体内成骨罕见报道。本实验通过将SMSCs体外扩增、培养、成骨分化，以及将SMSCs与羟基磷灰石/ 壳

聚糖/ 聚乳酸（hydroxylapatite/chitosan/polyL-laticacid，HA/CS/PLLA） 复合植入大鼠体内，探索SMSCs体内、体外分化成骨的能力，以期为构建组织工程骨提供种子细胞。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂、仪器

12 周龄雄性SD大鼠26 只，体质量200 ～ 250 g，由皖南医学院弋矶山医院中心实验室提供。FBS、胰蛋白酶-EDTA（HyClone 公司，美国）；H-DMEM 培养液（Thermo Fisher Scientific 公司，美国）；地塞米松、β- 甘油磷酸钠、维生素C、Ⅱ型胶原酶、HA、CS、PLLA、MTT、ALP 试剂盒、茜素红染液、氯化十六烷基吡啶（Sigma公司，美国）；Trizol试剂盒（Invitrogen 公司，美国）；PrimeScriptTM RT-PCR

试剂盒（Takara公司，日本）。Männedorf多功能酶标仪（Tecan公司，瑞士）；紫外分光光度计（GenovaNano公司，英国）；CytoFLEX流式细胞仪（BeckmanCoulter 公司，美国）；DP70 倒置荧光显微镜（Olympus公司，日本）；倒置相差显微镜（Leica公司，德国）；ImageJ 软件（National Institutes of Health公司，美国）。

1.2 SMSCs 分离培养及鉴定

1.2.1 SMSCs 分离培养 取SD 大鼠2 只，断颈处死，75% 乙醇浸泡15 ～ 20 min，打开膝关节腔取出滑膜，PBS 冲洗3 遍；将滑膜周围脂肪组织和部分结缔组织剥离干净，眼科剪将滑膜组织剪成1mm×1 mm×1 mm 大小碎块，加入10 倍体积的0.2% Ⅱ型胶原酶，37℃、200 r/min 震荡消化3 h；消化后过200 目滤网，以离心半径5 cm、1 000 r/min 离心5 min，弃沉淀重悬，接入培养瓶培养，置于37℃、

5%CO2 及饱和湿度恒温培养箱内。24h 后可见细胞贴壁生长，每3天换液1 次，待细胞生长至80% 融合时，0.25% 胰蛋白酶消化传代。倒置显微镜下观察细胞形态变化。取第3代细胞行Giemsa 染色，倒置荧光显微镜下观察。

1.2.2 流式细胞仪鉴定 根据文献[1] 方法，采用流式细胞仪对第3 代SMSCs 表面标记物CD147、CD90、CD105、CD44、CD117、CD34、CD14、CD45进行检测。

1.2.3 MTT 法绘制细胞曲线 取第1、2、3 代SM SCs，制备浓度为1.5×104 个/mL 的细胞悬液，接种于96 孔板，每孔100 μL。置于37℃、5%CO2 及饱和湿度恒温培养箱内，每孔加入5g/L MTT 100 μL，细胞培养箱中孵育4 h，弃培养液，将培养板晾干后每孔加入DMSO100 μL。培养后1 ～ 6 d 于酶标仪450 nm 波长处测定各孔吸光度（A）值。

1.2.4 成脂诱导鉴定 取第3 代SMSCs，以成脂诱导培养基（含10%FBS、2 mmol/L 谷氨酰胺、10 μg/ mL 胰岛素、1 mmol/L 地塞米松、0.5 mmol/L异丁基甲基黄嘌呤、200 μmol/L 吲哚美辛的DMEM

培养基）培养14d，PBS 洗净，行油红O 染色观察。

1.2.5 成骨诱导鉴定 取第3 代SMSCs，以成骨诱导培养基（含10%FBS、10 mmol/L β- 甘油磷酸钠、0.05 mmol/L 维生素C、100 mmol/L 地塞米松的DMEM 培养基）培养7 d 行ALP 染色鉴定，21 d 行茜素红染色鉴定。

1.3 SMSCs 体外成骨培养观测

1.3.1 实时荧光定量PCR检测相关基因表达 取第3 代SMSCs 按1.2.3 方法成骨诱导1、7、14、21、28 d，取贴壁细胞，按照Trizol 试剂盒说明书提取总RNA，以总RNA 为模板，参照PrimeScriptTM RT-PCR 试剂盒说明书，25 μL 作为逆转录反应体积进行PCR检测。

各引物序列见表1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。采用2-ΔΔCt 法检测成骨相关基因骨钙素（osteocalcin，OCN）、Ⅰ型胶原、ALP、Runx-2 mRNA 相对表达量，以β-actin 作为内参。

1.3.2 ELISA 法检测ALP活性 取第3代SMSCs，以1.0×105 个/ 孔接种于12 孔板，加入含10%FBS 的H-DMEM 培养基进行培养，待细胞达100% 融合时，于其中6 孔加入成骨诱导液作为成骨诱导组，其余6孔作为对照组，每个时间点设置1个孔板。分别于成骨诱导后1、3、5、7、9、11 d，PBS 漂洗2 次，加入1 mL PBS 溶液，4℃超声裂解细胞，采用ELISA 试剂盒和BCA 试剂盒分析细胞裂解液中ALP 和总蛋白（to tal protein，TP）含量，各组ALP 活性以ALP/TP

表示。

1.3.3 茜素红S法检测钙盐沉积 取第3 代SMSCs，以1.0×105 个/ 孔接种于12 孔板，加入含10%FBS 的H-DMEM 培养基进行培养，待细胞达100% 融合时，于其中4 孔加入成骨诱导液作为成骨诱导组，其余4孔作为对照组，每个时间点设置1个孔板。成骨诱导7、14、21、28 d，弃培养液，70% 乙醇固定30 min，PBS 清洗5 遍。0.5% 茜素红染液室温浸染30 min 后，去除多余染料，PBS 清洗3 遍，倒置荧光显微镜下观察。加入氯化十六烷基室温下浸润30min，吸弃上清液，于分光光度计562nm 波长处测量A 值，作为钙含量。

1.4 SMSCs 体内成骨培养观测

1.4.1 HA/CS/PLLA 支架材料扫描电镜观察HA/CS/PLLA 支架材料由中国科技大学微尺度实验室提供，制备方法参照文献[4]。将HA/CS/PLLA 支架材料PBS 冲洗后，3% 戊二醛固定3 h，乙醇梯度脱水，醋酸异戊酯溶液中浸泡20min，临界点干燥、喷金，扫描电镜观察。

1.4.2 细胞-支架复合物制备 将环氧乙烷消毒后的HA/CS/PLLA 材料置入培养皿中，取第3 代SMSCs 调整成浓度为1.0×106 个/mL 的细胞悬液，接种于支架材料上，每个材料接种10μL，置于37℃、5%CO2 及饱和湿度恒温培养箱中培养3 h，然后缓慢加入含10%FBS 的H-DMEM 培养基，复合培养72 h，备用。

1.4.3 实验分组及方法 取SD 大鼠24 只，随机分为实验组和对照组（n=12）。3% 戊巴比妥钠（30 mg/ kg）腹腔注射麻醉，无菌条件下切开右下肢皮肤，钝性分离肌肉，实验组于肌袋内植入复合培养72h 的细胞- 支架复合物，对照组仅植入支架材料。缝合切口，分笼饲养。

1.4.4 观测指标 ①大体观察：术后观察大鼠活动、切口愈合及进食情况。②X 线片观察：术后4、8 周，两组分别取6 只动物处死，于右下肢行X 线片检查，采用Image J 软件计算相对灰度值。③组织学观察：术后4、8 周，取出两组植入物，去除材料周围脂肪及纤维组织，PBS冲洗；标本于10% 多聚甲醛固定72 h，乙醇梯度脱水、石蜡包埋切片，片厚5μm，每个标本取3 张切片，常规行HE 染色，光镜下观察。高倍镜下随机测定每张切片3个非重复视野内新骨面积，取均值。

1.5 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数± 标准差表示，组内各时间点间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；两组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 SMSCs 分离培养及鉴定

2.1.1 形态学观察 分离的原代细胞24 h 后贴壁，呈不规则形状生长（图1 a）。第2 代SMSCs 形态混杂，主要以梭形、长梭形为主，可见少量圆形巨噬样细胞。第3代SMSCs 铺满瓶底，呈长梭

形，主要为滑膜成纤维样细胞（图1c）。第3 代细胞Giemsa 染色示细胞为长梭形成纤维样细胞。

2.1.2 流式细胞仪鉴定 第3 代SMSCs 流式细胞仪检测结果示，CD147、CD90、CD105、CD44 呈阳性表达，表达率分别为98.92%±0.21%、96.41%±0.18%、99.56%±0.17%、95.45%±0.29%；而CD117、CD34、CD14、CD45 呈阴性表达，表达率分别为4.53%± 1.23%、3.85%±1.07%、7.36%±2.34%、4.41%±1.21%。

2.1.3 MTT 法检测细胞增殖率 随着培养时间延长，第1 ～ 3 代细胞A 值均逐渐增高；第2、3 代细胞呈S 形增殖曲线，1、2 d 为平台期，3 ～ 5 d 为对数生长期，6 d 后细胞密度较大，细胞间接触抑制生长，进入平台期。

2.1.4 成脂、成骨诱导鉴定SMSCs 成脂诱导14 d，油红O 染色可见红染的块状脂滴；成骨诱导7d，ALP 染色可见细胞质咖啡样深染；成骨诱导28d，茜素红染色可见红色钙化灶。

2.2 SMSCs 体外成骨培养观测

2.2.1 实时荧光定量PCR检测相关基因表达  成骨分化晚期标志基因OCN在培养7 d 上升不明显；与1、7 d 比较，OCN 在14 d 后上升显著，28 d 达峰值，差异有统计学意义（P<0.05）。与培养1 d 相比，成骨分化早期标志基因Ⅰ型胶原在培养7d 上升显著，差异有统计学意义（P<0.05）；14、21、28 d 与1 d相比无明显上调（P>0.05）。而成骨标志基因ALP、Runx-2 在培养7 ～ 28 d 均明显上调，与1 d 时比较差异均有统计学意义（P<0.05）。

2.2.2 ALP 活性测定 成骨诱导组诱导1、3 d，ALP活性均增加不明显，5 d ALP 活性明显增强，7 d 时达峰值，9、11 d ALP 活性逐渐降低；5 ～ 11 d ALP 活性均显著高于1、3 d，差异有统计学意义（P<0.05），且5 ～ 11 d 各时间点间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。诱导后5、7、9、11 d 成骨诱导组ALP 活性均明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2.3 茜素红钙含量测定SMSCs 成骨诱导7 d 时

茜素红染色未见钙基质，14d 开始出现钙沉积，21d

可见钙化结节，28d 可见大量钙化结节和钙沉积；对

照组各时间点均未见红染的钙化灶。见图6。成骨

诱导组诱导培养14、21、28 d，钙含量显著高于7 d 时，

也均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见

表3。

2.3 SMSCs 体内成骨培养观测

2.3.1 HA/CS/PLLA 支架材料扫描电镜观察 扫描电镜观察示，材料表面分布着大小不等的孔隙，内部为三维网状结构，为细胞附着、生长以及营养物质运输提供了有利场所。

2.3.2 大体观察24 只大鼠全部存活，术后切口

均Ⅰ 期愈合，无炎性反应发生；实验期间动物进食正常。

2.3.3 X 线片检测 术后4、8 周，实验组与对照组均有高密度影，其中实验组骨密度高于对照组，周实验组相对灰度值分别为12.61±1.44和29.73±1.67，均分别高于对照组的4.85±0.84 和13.23±0.92，差异有统计学意义（t=13.964，P=0.000；t=25.962，P=0.000）。

3 讨论

3.1 SMSCs 来源和特征

SMSCs 来源于滑膜组织，而滑膜组织缺少血管，因此SMSCs原代培养中不会因血细胞的掺杂受到影响，并且滑膜可再生，在腔镜下也易于获取。滑膜细胞包含多种类型，主要有巨噬样细胞和成纤维样细

胞，SMSCs具有成纤维样细胞形态特征[5-6]；且体外培养中，SMSCs 增殖速率较其他MSCs 更快。因此，SMSCs 在组织工程中的应用更具优势。SMSCs 具有和其他MSCs 相似的表面抗原决定簇，迄今为止尚未发现SMSCs特有的表面抗原决定簇，但相较于BMSCs，SMSCs 的CD90 表达量更高。本研究发现SMSCs 高表达CD147、CD90、CD105、

CD44，而CD117、CD34、CD14、CD45 则呈阴性表达，与文献报道一致。

3.2 SMSCs 体外成骨分化

正常情况下滑膜细胞不具有成骨作用，而在病理情况下，如骨关节病患者的关节滑液中，发现有焦磷酸钙矿化颗粒，且关节缘有骨赘形成，体外培养其滑膜成纤维细胞能形成矿化结节[9]，说明滑膜细

胞具有成骨分化潜能。SMSCs成骨诱导既往已有学者研究，本实验使用的成骨诱导液，其中地塞米松参与BMSCs增殖及调控早期Ⅰ型胶原形成；β-甘油磷酸钠属于有机磷类，可被ALP 水解，释放无机

磷，从而促进细胞外基质矿化。本实验中SMSCs 体外成骨诱导后ALP染色和茜素红染色阳性，验证了该成骨诱导液的可行性。

为了进一步从转录水平上验证这一结果，我们对成骨诱导后不同时间点SMSCs成骨相关基因的表达进行检测。OCN是成骨分化晚期的标志基因，其在诱导1～ 7 d 上升并不明显，而14 d 后上升显著，并在28 d 达最大值（P<0.05）；而Ⅰ型胶原、ALP、Runx-2 均为成骨分化早期的标志基因，尤其在1～ 7 d 上升显著（P<0.05），7 d 后开始回落。ALP是骨形成必需的酶，也是评价骨形成的常见指标，细

胞外基质中ALP增加会促使细胞外基质矿化，表现为大量钙盐沉积。实验中细胞在诱导后1、3 d ALP增加并不明显，5 d ALP 活性开始明显增强，7 d 达峰值。茜素红染色可以看出，在成骨诱导14d 开始有钙盐沉积，21d 有钙化结节形成，28d 有大量被染成红色的钙盐沉积和钙结节。提示SMSCs成骨诱导 7 d，细胞外基质开始成熟；14 d 进入细胞外基质 矿化期，产生大量钙盐，从而实现SMSCs成骨分化。

3.3 SMSCs 体内成骨

为了观察SMSCs在体内能否形成新骨，本实验使用了骨组织工程支架材料HA/CS/PLLA。HA/ CS/ PLLA 具有良好的骨传导性和骨诱导性，

且植入体内后未发现排斥反应和毒性反应。由于SMSCs成骨分化与其所处环境有关，因此我们将SMSCs与HA/CS/PLLA 复合培养72 h 后植入大鼠下肢肌袋内。4 周和8 周分别行X 线片观察和组织学观察，发现两组均有新骨形成，而实验组成骨量均高于对照组（P<0.05），提示SMSCs 可在体内异位成骨；而4 周时材料内可见大量软骨基质，对照组未见明显软骨基质，提示SMSCs可能是经软骨成骨。

骨诱导材料的异位成骨机制目前尚不明确，其可能机制为：HA/CS/PLLA周围的结缔组织和血管组织可成为MSCs和成骨祖细胞来源，在骨诱导材料适宜的微环境下可促进细胞向成骨细胞分化并

形成新骨。本实验结果表明，SMSCs在体外经成骨诱导后可转化为成骨细胞；而在体内适宜的成骨信号分子和微环境作用下也可转化为成骨细胞，HA/CS/PLLA支架材料可能为SMSCs体内成骨分化

提供了适宜的微环境。HA/CS/PLLA支架材料具有多孔结构，有助于复合SMSCs以及周边MSCs、成骨细胞及血细胞，促进其在材料内黏附、增殖和分化，也有利于各种生长因子和营养物质在支架内均匀

分布，增加了其“成骨微环境”的作用范围，最终诱导SMSCs 向骨前体细胞转化，在体内异位成骨。本实验SMSCs在植入大鼠体内前并未经体外成骨诱导，虽然有学者认为体外成骨诱导可提高MSCs体

内成骨能力，但体外成骨诱导会对细胞表型产生破坏，不仅增加了体外培养时间，甚至存在激发恶性肿瘤的风险，给临床应用带来诸多不确定因素。

综上述，SMSCs经成骨诱导后可分化成骨，在体内亦可形成新骨，为骨组织工程种子细胞的选择提供了新参考。