腰痛作为一种普遍的健康问题，其致残率超过10%。椎间盘退变是腰痛的主要诱因之一。当前治疗腰痛的方法因其副作用或并发症较高而备受争议，因此迫切需要深入研究椎间盘退变的机制以及生物治疗方法。

2024年1月2日，中山大学附属第一医院脊柱外科王建儒/郑召民教授团队在《Nature Communications》杂志（IF=16.6）在线发表了题为“Serglycin secreted by late-stage nucleus pulposus cells is a biomarker of intervertebral disc degeneration”的论文。该研究发现了Serglycin(SRGN)，一种广泛存在于细胞内外基质中的糖蛋白，是椎间盘退变（IVDD）的关键生物标志物，同时还定义了一群以SRGN+为标志物的退变晚期髓核细胞群【1】。

本研究科学示意图(图源：Chen, Fan et al. Nature communications vol. 15,1 47. 2 Jan. 2024)

【研究背景】

腰痛（Low back Pain，LBP）是常见的疾患，已成为门诊患者就诊的第二大病因，并成为45岁以下人群劳动力降低的主要原因【2】。椎间盘退变及其继发的一系列疾病是腰痛的主要病因，也是临床上十分常见的病种，关系到广大人群的健康问题。对椎间盘退变机制及生物治疗的深入研究对于减少腰痛发病率、提高生活质量和减少社会经济损失有着重要的意义。

椎间盘是由内层富含蛋白聚糖的胶冻状髓核（Nucleus pulposus，NP），外层多层胶原纤维交织的纤维环（Annulus Fibrosus，AF）和椎体上下软骨终板（Cartilage Endplate, CEP）组成的一个特殊的相对密闭的组织。椎间盘退变的病理生理学表现主要为椎间盘髓核细胞（NPCs）凋亡、细胞外基质（COL1、COL2、ACAN等）的异常降解、以及炎性反应（IL-1β、TNF-α、IL-6、巨噬细胞浸润等）的病理性增强【3】。

Serglycin是一种糖蛋白，过去的研究发现它在炎症和肿瘤中起到关键作用，并能够被外源性因素调节。然而，其在椎间盘退变中的具体作用机制尚未深入研究【4】。

王建儒教授团队多年来致力于长期从事脊柱/椎间盘退变等方面基础与临床研究，在脊柱领域具有丰富的研究经验和前期基础。团队近年来一直跟踪椎间盘研究领域的前沿信息，致力于临床工作和实验室基础研究，并取得了良好的研究成果，并在Bone Res、Arthritis Rheum、J Biol Chem、iScience、Osteoarthr Cartilage、Experimental & Molecular Med、J Orthop Res 等杂志发表SCI收录论文30余篇。

1. 生物学特征的解析：人髓核细胞可通过单细胞分析分为6个亚群

在本研究中，研究团队通过对人髓核组织的单细胞分析，通过椎间盘髓核细胞标记基因（ACAN和SOX9）注释了髓核细胞，并通过进一步的无监督聚类算法，结合各个亚群细胞的生物学功能分析，揭示了髓核细胞的异质性，将髓核细胞分为6个亚群（图1）：Pro-NPC：NPC祖细胞，标记有ACAN+、SOX9+、UBE2C+和TOP2A+；Fibro-NPCs：纤维性NPCs，标记为ACAN+、SOX9+、FBLN1+；IR-NPCs：整体调节性NPCs，标记为ACAN+、SOX9+、CH3L2+；Met-NPCs+：代谢性NPCs，标记为ACAN+、SOX9+、DKK1+；Adh-NPCs：粘附性NPC，标记有ACAN+、SOX9+和MSMO1+；

图

1. (图源：Chen, Fan et al. Nature communications vol. 15,1 47. 2 Jan. 2024)

2.退变晚期髓核细胞以及其标记基因SRGN在IVDD中的关键作用

研究团队通过对6个亚群髓核细胞的拟时序分析，同时分析各亚群细胞中退变性髓核细胞在总髓核细胞中的占比改变，结合各个NPC亚群的生物学功能分析，发现Fibro-NPCs可能处于髓核细胞退变进程末期的一种细胞群，研究团队将其定义为退变晚期髓核细胞（Late-stage NPC），并推测其在椎间盘退变中起重要作用（图2）。随后，为了探索针对该群细胞更有意义的生物学标志物，我们结合Bulk RNA-seq的整体中各基因表达水平和退变晚期髓核细胞中各基因的表达水平，我们发现SRGN可能在其中起关键作用，并进行了相关组织学验证（图2）。以上结果表明，在椎间盘退变过程中，高表达SRGN的退变晚期髓核细胞在其中起重要作用。

图2. (图源：Chen, Fan et al. Nature communications vol. 15,1 47. 2 Jan. 2024)

3. SRGN与炎症反应：抑制 SRGN的表达可以有效缓解椎间盘退变的进展

研究团队为了验证SRGN在IVDD中的重要作用，构建了SRGN敲除小鼠，并建立腰椎间盘纤维环针刺退变模型（AFP），通过MRI、micro-CT等检查以及H&E、Safranin-O、IHC 和 IF 染色对组织进行分析（图3）。发现抑制 SRGN 有效缓解了 IVDD 的进展。

图3. (图源：Chen, Fan et al. Nature communications vol. 15,1 47. 2 Jan. 2024)

4. SRGN诱导椎间盘内炎症反应

局部炎症反应是 IVDD 的主要原因之一。因此，团队研究了晚期NPC中SRGN分泌增加与局部炎症反应之间的相关性。首先通过前期Bulk RNA-seq与ScRNA-seq初步判断了IL1B、TNF 和 CCL3 三个基因在退变晚期 NPC 中上调。进而利用人炎症因子芯片进行炎症因子的定量测量，并发现IL-1β、TNF-α、CCL3炎症因子与SRGN高度相关。随后通过构建SRGN Si-RNA沉默SRGN基因的表达以及利用外源性重组SRGN蛋白的处理，进一步揭示了SRGN 在 IVDD 局部炎症反应中发挥了重要作用（图4）。

图4. (图源：Chen, Fan et al. Nature communications vol. 15,1 47. 2 Jan. 2024)

5. 退变晚期髓核细胞分泌的SRGN通过激活NF-kappaB通路促进炎症因子的分泌。

为了进一步了解 SRGN 在 IVDD 期间调节局部炎症反应的机制，研究团队通过前期测序数据的分析发现NF-kappaB通路的显著富集。同时在单细胞中，将细胞以SRGN表达的高低分为“SRGN-High”和“SRGN-Low”来分别从生信角度模拟SRGN过表达以及敲低表达的情况，并对信号通路进行富集，初步确定了NF-kappaB通路在SRGN下游的重要作用。后续通过Western Blot的进一步筛选，以及细胞实验进行验证（图5）。以上结果表明 NF-kappaB 信号通路参与了SRGN 介导的椎间盘退变期间退变晚期髓核细胞局部炎症反应水平的调节。

图5. (图源：Chen, Fan et al. Nature communications vol. 15,1 47. 2 Jan. 2024)

6. SRGN促进巨噬细胞浸润

巨噬细胞在 IVDD 炎症反应中也中发挥着重要作用。通过单独对巨噬细胞进行分群，以及与M1型巨噬细胞（CD68+，CD11c+）进行比较，并结合不同细胞群在不同退变等级髓核细胞中的占比分析，发现其中一群“TNF+巨噬细胞”可能在椎间盘退变中起重要作用，后续的通路分析以及配体受体分析，结合细胞学实验，揭示了高表达SRGN的退变晚期髓核细胞通过促进巨噬细胞浸润和 M1 极化而加剧局部炎症反应(图6)。

图6. (图源：Chen, Fan et al. Nature communications vol. 15,1 47. 2 Jan. 2024)

7. 瑞香素缓解椎间盘退变的探索与初步验证：瑞香素通过降低椎间盘局部炎症反应水平缓解椎间盘退变。

研究团队尝试寻找一种药物或化合物是否可以通过调节局部炎症反应来有效缓解 IVDD。在没有 SRGN 实验结构的情况下，使用 AlphaFold2 软件预测 SRGN 结构并评估其可靠性。并利用Autodock进行虚拟对接，发现瑞香素可以与SRGN存在潜在接合可能性，并利用细胞热稳定实验进行体外验证。进一步地，研究团队通过多重手段，多个层面验证了瑞香素对SRGN功能、对局部炎症反应以及巨噬细胞浸润功能的抑制，并最后在动物实验结果中发现瑞香素可以有效的改善椎间盘退变（图7）。

图7. (图源：Chen, Fan et al. Nature communications vol. 15,1 47. 2 Jan. 2024)

小结与展望

综上所述，研究人员综合利用多种测序结合的生物信息学、动物模型、细胞生物学和分子生物学方法等技术手段，揭示了人椎间盘髓核细胞的异质性，并发现一群高表达SRGN的晚期退变髓核细胞在椎间盘退变中的关键作用；同时揭示了SRGN与椎间盘内局部炎症反应的重要相关性，并发现SRGN通过激活NF-kappaB通路诱导髓核细胞验证因子的分泌，同时诱导巨噬细胞的浸润和促进M1型巨噬细胞的极化，以此介导椎间盘内局部炎症反应；进一步还发现了瑞香素可以通过抑制SRGN的促炎功能，缓解椎间盘退变的发展，改善椎间盘退变，为椎间盘退变提供了潜在的药物方案，为椎间盘退变的治疗提供了新的方向和希望。

中山大学附属第一医院脊柱外科的王建儒教授和郑召民教授为该论文的共同通讯作者，助理研究员/住院医师陈凡以及研究生雷林川、陈顺伦、赵卓阳为本论文的共同第一作者。本研究受到多项国家自然科学基金（NO.81972098；NO.82002341）等项目的资助。研究团队将继续在这一领域进行深入研究，以推动更多创新性的解决方案，为患者提供更有效的腰痛治疗手段。

参考文献：

1. Chen F, Lei L, Chen S, Zhao Z, Huang Y, Jiang G, Guo X, Li Z, Zheng Z, Wang J. Serglycin secreted by late-stage nucleus pulposus cells is a biomarker of intervertebral disc degeneration. Nat Commun. 2024 Jan 2;15(1):47.

2. Chou R. Low Back Pain. Ann Intern Med 2021, 174(8): ITC113-ITC128.

3. Ramaswami R, Ghogawala Z, Weinstein JN. Management of Sciatica. N Engl J Med 2017, 376(12): 1175-1177.

4. Kolset SO, Pejler G. Serglycin: a structural and functional chameleon with wide impact on immune cells. J Immunol 2011, 187(10): 4927-4933.

作者介绍

王建儒

郑召民

中山大学附属第一医院主任医师，教授，博士生、博士后导师。广东省首批医学领军人才，国家科技进步奖二等奖获得者。中山大学疼痛研究中心副主任，中山大学附属第一医院脊柱外科副主任，北京首都医科大学脊柱畸形临床诊疗与研究中心副主任，郑州大学脊柱畸形研究所名誉所长，澳大利亚新南威尔士大学兼职教授，香港大学骨科荣誉教授、博士生导师，南方科技大学医学院、工学院生物医学工程系访问教授、博士生导师，新疆医科大学第六附属医院（新疆自治区骨科医院）客座教授，石河子大学医学院附属红星医院（新疆建设兵团第十三师红星医院）特聘教授。中山大学附属第一医院脊柱侧弯MDT首席专家，粤港澳大湾区脊柱侧弯畸形联盟理事长。

2024亚太微创脊柱外科学会（PASMISS）候任主席，亚太脊柱外科学会（APSS）委员。中华医学会骨科学分会脊柱外科学组委员，中华医学会疼痛学分会脊柱学组副组长，中国医师协会骨科医师分会脊柱学组委员，中国医师协会疼痛科医师分会脊柱工作委员会副主任委员，中华预防医学会脊柱疾病预防与控制专业委员会副主任委员，中国医药教育协会骨科专业委员会副主任委员、骨科脊柱分会名誉主任委员兼脊柱畸形工作组组长。中国康复医学会脊柱脊髓专业委员会常委兼微创脊柱外科学组、腰椎学组、感染学组副组长、畸形学组委员。

中国康复医学会颈椎病专业委员会常委，中国康复医学会骨质疏松专业委员会常委，SICOT中国部数字骨科专委会副主任委员兼脊柱专委会常委。中国中西医结合学会脊柱专业委员会常委，广东省医学会疼痛学分会副主任委员等。

《Asia Spine Journal》（IF 2.3）（亚太脊柱外科学会杂志）副主编，《Journal Of Orthopedics Translation》(IF 6.6)《JOR Spine》(IF 3.7 )《Spine Deformity》(IF 1.6)《Journal Of Orthopaedic Surgery》(IF 1.6)《中华骨科杂志》《中华创伤骨科杂志》《中华骨关节外科杂志》《中华解剖与临床杂志》编委，《中国脊柱脊髓杂志》《中国骨与关节杂志》常委，《中国骨科临床与基础研究杂志》副主编。

国家自然基金项目6项，团队近10年18项。主编主译书22部，文章214篇，SCI88篇，第一或通讯作者IF大于10分。Nature Commucation, Bone Research等8篇（共15篇），大于5分8篇。H-index 30, 引用2460次。

来源：中山大学附属第一医院

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