刘巍峰:骨肉瘤预后相关致病基因的研究进展
2024-07-23 文章来源:中国骨与关节杂志2024年5月第13卷第5期 作者:刘璐,焦辰波,刘巍峰 点击量:79 我要说
骨肉瘤是一种罕见的肿瘤,任何年龄均可诊断,全球范围内其发病年龄呈双峰分布,第一个高峰出现在15~19岁(8例/百万/年),第二个高峰出现在75~79岁(6例/百万/年)。常发生在股骨(42%)、胫骨(19%)和肱骨(10%),化疗出现之前,约74%的局部骨肉瘤患者在1年内出现肺转移。在20世纪70年代,引入联合化疗,即基于甲氨蝶呤、顺铂、阿霉素(可添加异环磷酰胺)的一线化疗及其它药物如干扰素的强化治疗后,局部骨肉瘤患者的5年生存率提高至60%。目前,对于患可切除骨肉瘤的患者,最常见治疗方法包括术前新辅助化疗及术后辅助化疗。对于化疗不敏感、转移及复发的患者其5年生存率低于20%。骨肉瘤患者的总体生存率较低是由于其在不可手术环境中具有耐药性和早期血行播散的特点;此外,目前的治疗常遇到化疗耐药和肿瘤免疫逃逸的瓶颈。并发症和致命毒性限制了化疗药物的使用。
识别驱动基因理解癌症生物学是开发更有效的检测与治疗方法的关键。骨肉瘤的驱动因素包括基因的点突变、拷贝数变异(CNA)、结构变异(SV);重排发生在DNA链断裂,然后重新连接到同一染色体或另一染色体上的不同DNA片段上。在正常二倍体基因组中,当拷贝数发生变化时,就会发生CNA。拷贝数增加可激活癌基因驱动程序,而拷贝数减少或DNA片段丢失可使TSG驱动程序失活。遗憾的是,骨肉瘤的遗传复杂性与可供研究的患者人数较少限制了新疗法的确定。
高级别骨肉瘤复发性染色体区拷贝数畸变主要表现在染色体臂1p、1q、4p、5p、6p和8q的反复增益和染色体臂1p、1q、2q、3q、6q、7q、8p、10p、10q、12p、13q、15q、16p和16q的反复损失。驱动基因赋予体细胞组织中的细胞某些选择性优势,其突变形式影响一组关键细胞功能的稳态发育。遗传学揭示了骨肉瘤基因组的复杂性与不稳定性,要将这些信息转化为成功的治疗方法,有赖于对骨肉瘤遗传学的深入了解、对驱动基因的识别和基因靶向的探索。
一、骨肉瘤的重要驱动基因
1.TP53:
抑癌基因TP53在骨肉瘤中的失活主要是基因突变,突变率从31%到82%不等,其中大多数是易位(90%)。TP53基因失活导致TP53通路缺失,从而使细胞无法对DNA损伤作出反应,进而介导基因组不稳定性并触发骨肉瘤肿瘤发生。
细胞周期由细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)进行调控,在G1-S转变、S期和G2-M转变处存在的检查点通过在有丝分裂开始之前预留时间修复受损的DNA来维持基因组完整性。TP53异常会影响G1检查点,为了维持基因的完整性,肿瘤细胞对G2检查点的依赖性增加。因此,破坏G2检查点稳定性的药物有可能启动TP53突变型骨肉瘤细胞的死亡。WEE1是一种酪氨酸激酶,是G2-M检查点的守门员(gatekeeper),靶向WEE1进行抑制可损害G2-M检查点从而为增强DNA损伤剂的活性提供机会。目前的临床试验结果表明WEE1抑制能够使胰腺癌细胞对吉西他滨和辐射敏感从而增强全身和局部疾病控制。而WEE1抑制剂是否能够使骨肉瘤患者受益尚未明确。
迄今为止,多项研究评估了TP53在与骨肉瘤预后的相关性,其结果有所差异。在一项涉及609例患者的荟萃分析中,Fu等发现,TP53上调与3年总生存率及3年无病生存率下降明显相关,故认为TP53作为骨肉瘤患者预后的有效标志物,Chen等对210例患者的研究支持这一点,他们发现TP53突变对2年总生存率产生不利影响。在Yao等对17项共595例患者的荟萃分析中,结果表明TP53阳性免疫染色与2年生存率下降相关,尤其是在接受新辅助化疗和手术治疗的骨肉瘤患者中,这种相关性比仅接受手术治疗的患者更强,且TP53与3年和5年生存率无明显关联。目前的数据在TP53的异常与骨肉瘤短期临床结果的关联上较为一致,即TP53可作为骨肉瘤的短期预后标志物,而从骨肉瘤治疗发展的历史视角来看,一些治疗如辅助化疗存在争议的原因往往在于其长期结果与短期结果并不一致,故还应重视其TP53对长期预后的价值,揭示它须进一步的大规模前瞻性试验。
2.编码蛋白(RB1):
RB1突变见于40%~60%的散发性骨肉瘤,是骨肉瘤中第二常见的突变基因。RB1是细胞周期的负调节剂,在没有丝分裂信号的情况下,Rb蛋白的丢失会导致基因组不稳定。RB1基因突变后与E2F转录因子分离,推动细胞周期从G1到S阶段的进展,随后转录参与细胞周期进展的多个基因,推动骨肉瘤与基因组进化的研究表明,RB1突变是早期事件之一。RB1肿瘤抑制基因的功能丧失突变是癌症(包括骨肉瘤)的关键驱动因素。有小鼠模型表明TP53改变是骨肉瘤的主要起始事件,RB1失活加速TP53失活模型中肿瘤形成。
一项纳入了491例骨肉瘤患者的荟萃分析表明RB1突变与骨肉瘤对化疗的组织学反应显著降低及高转移风险相关,并据此认为RB1改变可作为骨肉瘤患者治疗的预后标志物。具体而言,相比于RB1功能完好无损的骨肉瘤患者,RB1功能丧失导致骨肉瘤患者病死率增加1.62倍。
3.CDKN2A:
CDKN2A是常染色体显性基因,它通过CDKN2A/p16靶向ERK途径和TGF-β1来抑制肿瘤细胞的转移潜力,通过CDKN2A/p14诱导短暂的G2停止和随后的凋亡来抑制缺乏功能性p53的癌细胞的生长。在骨肉瘤中,CDKN2A突变映射到体细胞突变的位点。研究发现,CDKN2A位点的纯合子缺失是骨肉瘤发展的早期事件。不仅使细胞逃脱了CDKN2A/p16的细胞周期控制,而且通过瞬间删除CDKN2A/p14破坏p53途径来阻止凋亡,使得骨肉瘤细胞不受控制地增殖。
在1244例骨肉瘤患者癌症易感基因致病变异的评估研究中,28.0%的骨肉瘤患者在癌症易感基因中具有致病性/可能致病性变异,其中18.4%的变异是常染色体占主导地位的基因。CDKN2A在骨肉瘤患者中致病/可能致病变异的频率第二高(1.2%),且在年龄最小的患者(0~10岁)中变异的频率最高(2.0%)。这些发现提示,对于新诊断为骨肉瘤的患者,特别是年轻患者,基因测试具有重要意义,因为这些患者更有可能具有潜在的临床相关疾病。根据这些发现,有学者建议CDKN2A MLPA与IHC相结合,以提供敏感且快速的预后工具,用于识别可能受益于替代治疗方案的生存率非常低的骨肉瘤亚群。有研究表明CDKN2A与肉瘤的不良预后显著相关。
二、骨肉瘤的其它致病基因
1.ATRX:
ATRX是多蛋白复合物的一部分,作为染色质重塑剂、组蛋白和DNA甲基化的调节剂发挥重要作用,可调节染色质重塑、核小体组装和端粒维护,从而保持染色体稳定性。端粒维持机制(TMM)包括端粒酶激活和端粒的替代延长(ALT)。ATRX的丧失、基因组不稳定和DNA损伤反应的改变是ALT的标志。可能的机制为ATRX缺陷导致的有丝分裂和(或)双着丝粒染色体缺陷会形成微核的滞后染色体,从而导致DNA损伤和ALT系中持续的基因组不稳定性。
Chen等对34例儿科骨肉瘤患者的全基因组测序分析表明,除了TP53(95%)和RB1(29%)之外,ATRX基因在53%的小儿骨肉瘤中引起复发性体细胞改变。在美国癌症研究项目基因组学证据肿瘤信息交换(GENIE)联盟调查的288例骨肉瘤患者中,ATRX是最常见的突变基因之一。ATRX表达下降与更具侵袭性的肿瘤细胞表型有关,包括生长、迁移、侵袭和转移增加。
2.MDM2:
MDM2是一种癌基因,是记录最齐全的p53负调节因子,其位于12号染色体长臂上,编码E3泛素蛋白连接酶,主要通过介导p53泛素化来抑制p53,从而导致p53核输出和蛋白酶体降解。另外,MDM2具有独立于p53的功能,其已被证明可以调节多种致癌蛋白(RAS、MYC)的稳定性和活性并在基因表达、上皮-间质转化和炎症性疾病的发病机制中发挥作用。
在临床实践中,MDM2扩增检测用于辅助诊断低度恶性骨肉瘤(根据相对于骨皮质的位置分为骨旁骨肉瘤、低度中央型骨肉瘤以及这些肿瘤的去分化变异型,其通常是不良预后的标志。此外,在高级骨肉瘤中发现MDM2和(或)CDK4扩增/过表达表明低级骨肉瘤的去分化,排除了原发性常规高级骨肉瘤。MDM2和CDK4免疫染色也用于低度恶性骨肉瘤和良性纤维或纤维骨病变的鉴别诊断。MDM2靶向疗法目前正在进行临床试验。
3.PTEN:
PI3K-mTOR通路通常由PTEN丢失激活,正常情况下PTEN依赖其磷酸酶活性拮抗PI3K/AKT途径,PTEN的丢失导致PI3K/Akt细胞增殖途径多活化和细胞迁移增加,同时,AKT活性增加将导致MDM2磷酸化和核转位增加,导致p53降解,进而驱动骨肉瘤的发生与转移。
全外显子测序显示PTEN缺失参与了骨肉瘤进展和肺转移的后期阶段,表明其可能作为预后因素。Zheng等研究表明,低水平PTEN表达患者的无病生存期和总生存期更短。Robl等发现PTEN的存在与骨肉瘤患者肺转移的抑制紧密相关。尽管关于PTEN的研究较少,但目前的结果表明PTEN在骨肉瘤进展中起着显著的作用,其状态评估可能有助于预测患者预后。
4.BRCA1/2:
骨肉瘤具有相对高水平的同源重组缺陷特征(BRCA1/2缺陷)。Kovac等对31个骨肉瘤的全外显子测序,发现超过80%的骨肉瘤表现驱动骨肉瘤发生的BRCA样表型,即单碱基替换、杂合性丢失(LOH)或BRCA1/2缺陷肿瘤特征的大规模基因组不稳定。骨肉瘤外显子组的单核苷酸变异(SNVs)光谱表明,C:G>T:A是最常见的碱基替换,其次是C:G>A:T和T:A>C:G。BRCA样表型的肿瘤通常存在同源重组修复(HRR)缺陷。需要注意的是,由于骨肉瘤是多克隆性的,BRCA样表型可能不仅由BRCA1/2突变单独导致,而是由同源重组途径的其它基因突变导致的,每种突变均具有额外的生物学特性。
在骨肉瘤细胞系中可看到对PARP抑制剂的反应。有研究表明骨肉瘤细胞系对PARP抑制剂talazoparib的反应与HRR修复缺乏而导致的基因组不稳定程度有关,进一步实验表明其与BRCA缺乏的基因特征相关。因此,研究BRCA缺乏特征对于骨肉瘤患者PARP抑制剂或与化疗联合使用的新型治疗策略的开发具有重要意义。数据表明PARP抑制能增加顺铂在体外和体内诱导的肿瘤细胞致死率。
5.Rab22a基因融合:
染色体易位源性变异Rab22a及其产物Rab22a-NeoFs已被证明是骨肉瘤肺转移的驱动因子。位于20q13.32的Rab22a基因的氨基酸编码区与20号染色体的6个倒置内含子或非翻译区反向并列产生融合基因。该基因的翻译产物是Rab22a-NeoFs,其中最长的是Rab22a-NeoF1,它由Rab22a的1~38个氨基酸与DOK5的第1外显子和第2外显子之间的内含子倒置序列结合而成,具有驱动骨肉瘤肺转移的能力。形成Rab22a-NeoF1会导致赖氨酸7(K7)的表面暴露,使其在K7处被p300/CBP乙酰化,从而促进GTP结合的RhoA从SmgGDS-607中释放,诱导RhoA的活性增加。该调节可能提供一种策略,通过靶向该乙酰化事件(如C646和SA)来治疗骨肉瘤转移患者。
总体而言,这些基因在骨肉瘤的发展中起着一定的作用,ATRX突变与BRCA 1/2缺陷的基因特征导致基因组的不稳定性,为骨肉瘤的形成提供了有利条件,PTEN丢失激活PI3K-mTOR通路、Rab22a基因融合驱动骨肉瘤的转移。MDM2通过灭活p53肿瘤抑制蛋白来增强肿瘤形成。CDKN2A缺失会激活CDK4/CDK6,从而导致更高的RB磷酸化并驱动细胞周期进展。
三、靶向通路及药物
1.mTOR:
研究发现骨肉瘤细胞中mTOR信号异常激活,是骨肉瘤发生发展的关键机制之一。mTOR是自噬的关键调节剂,自噬在肿瘤的整个阶段都发挥保护细胞的作用,但早期和晚期其保护的对象不同从而分别对肿瘤产生抑制作用和促进作用:在肿瘤发生的早期,它通过保护正常细胞免受不稳定因素的影响,抑制其向肿瘤细胞转化。在晚期,最初的肿瘤细胞已经形成,自噬帮助肿瘤细胞抵御内外压力从而赋予其应激耐受性,使肿瘤细胞能够在不利条件下生存和增殖。
mTOR的通路激活可促进骨肉瘤细胞的增殖和转移,并抑制细胞内细胞凋亡和自噬过程。有研究表明自噬缺陷是骨肉瘤化疗耐药性产生的原因之一。mTOR抑制剂在体内外均可抑制骨肉瘤细胞的生长,该靶向通路可抑制肿瘤细胞的生长。但目前的研究并未确定这些有益效果是否可以归因于自噬的增加。突变基因的通路分析、个体基因组的临床解释和基因组筛选已证明骨肉瘤对PI3K/mTOR通路激活的依赖性。近年来,mTOR抑制剂被广泛应用于骨肉瘤的治疗,取得了一定的疗效。相关的药物有依维莫司和雷帕霉素。
最著名的mTOR抑制剂是雷帕霉素,其作用于磷酸肌醇3-激酶(PI3K)通路的下游。最近的研究表明,雷帕霉素在治疗人骨肉瘤中具有显著的抗肿瘤活性,随着药物剂量的增加,即低剂量组(0.5 mg)、中剂量组(1.0 mg)、高剂量组(2.0 mg),其对人骨肉瘤MG-63细胞的增殖及mTOR mRNA表达的抑制作用更加显著]。但雷帕霉素的单一疗法具有局限性,原因在于其本身的药代动力学特性并不理想,雷帕霉素及其类似物无法抑制所有mTORC1功能,且不具备细胞毒性作用,因此开发了几种具有改进药理学特性的类似物(称为雷帕霉素类似物)来抑制mTORC1,用于不同类型癌症的抗癌治疗,包括替西罗莫司和依维莫司等。
2.PI3K/AKT通路:
PI3K/Akt通路的激活促进骨肉瘤启动和发展的多个病理过程,在骨肉瘤进展中起关键作用。在骨肉瘤中,PI3K/AKT通路主要通过生长因子,如胰岛素生长因子-1(IGF-1)和表皮生长因子(EGF)的诱导和基因突变激活。IGF-1通过其响应生长激素暴露与其受体的相互作用在纵向骨生长中起关键作用。IGF-1受体激活会诱导信号转导蛋白(如IRS-1/2和SHC)的募集和刺激,从而触发PI3K/AKT和RAS/MAP激酶信号级联反应。PTEN被认为是Akt的有效负调节因子,被认为在控制PI3K/Akt信号激活中起着关键作用。
3.VEGF通路:
VEGF的主要作用是促进血管内皮细胞增殖和血管生成,从而提供肿瘤生长所需的氧气和营养物质。在骨肉瘤中,VEGF的表达水平通常明显升高,促进肿瘤细胞的大量增殖和侵袭力。Yang等对骨肉瘤患者的组织切片进行的实验表明,VEGFA在74%的骨肉瘤患者中表达,VEGFA阳性骨肉瘤患者的无进展生存期明显低于VEGFA阴性骨肉瘤患者,VEGFA基因扩增和VEGFA蛋白表达升高与骨肉瘤患者的微血管密度和不良无瘤生存显着相关。
四、总结
总之,利用生物标志物预测对特定分子靶向治疗反应(或耐药)的定制治疗是精准医疗的核心理念。靶向治疗为精准医疗带来了新希望,但由于骨肉瘤的高度异质性和低发生率,骨肉瘤几乎没有反复发生的靶向突变,每个驱动因子仅在一小部分患者中发现,因此尚未确定适合广泛治疗的靶点,靶向药物的试验结果总体上不理想。
鉴于骨肉瘤的罕见性,目前可用的数据并未提供足够的样本数量来得出有影响临床试验设计。骨肉瘤基因组的复杂性需要积累足够的生物学数据进行大量的研究来克服。对于已经提名的大量候选基因,有必要进行有鉴别力的临床前研究,以确定临床验证的最佳生物标志物。
未来需对足够大的样本集进行整合基因组分析,剖析高级别骨肉瘤在突变、基因表达和表观遗传学特征方面存在的异质性。希望未来能够有更多大型基因组学研究提供丰富的、可公开获取的数据资源,这将对骨肉瘤的研究产生重大影响,以期改善骨肉瘤患者的预后。